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    質(zhì)粒的一般實(shí)驗(yàn)步驟

    點(diǎn)擊次數(shù):1156  更新時(shí)間:2023-06-13
    質(zhì)粒是使用廣泛的基因操作工具,可以進(jìn)行編碼基因、microRNA、lncRNA的功能研究、啟動(dòng)子活性、轉(zhuǎn)錄因子及3’UTR調(diào)控研究等。
    實(shí)驗(yàn)步驟:
    1)質(zhì)粒提取
    1.10,0001min離心收集1.5-5ml菌液沉淀于1.5ml離心管中
    2.加入100溶液1,振蕩至懸浮
    3.加入200溶液2,立即輕柔顛側(cè)離心管6次,使菌體充分裂解,隨后將離心管冰上放置3分鐘
    4.加入150山溶液3,立即溫和顛倒離心管數(shù)次,冰上放置3分鐘,10,00g離心10mins
    5.將步驟4的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管(盡量去除雜質(zhì)),加入等體積的苯酚/氖仿/異成醇混
    合均勻10,000離心5min
    6.將步驟5的上清轉(zhuǎn)移至新的離心管,加入2倍體積的無水乙醇,室溫放置5-1omin,沉
    降DNA
    7.10000g離心10分鐘,棄乙醇,保留沉淀,加入1ml706的乙醇洗滌沉淀,10,000離心5分鐘
    8.倒掉乙醇溶液,用吸水紙吸凈管壁上的水珠,室溫蒸發(fā)痕量乙醇
    9.加入適量含Rnase的TE或滅菌雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA
    2)質(zhì)粒鑒定瓊脂糖礙膠電泳
    灌膠:膠中加入芡光染料< SYBR Green)
    加樣:質(zhì)粒+上樣緩沖液→混勻
    電泳
    結(jié)果觀察:UV燈下
    實(shí)驗(yàn)分析:
    裂解細(xì)胞中除含有質(zhì)粒DNA外,還含有基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì),因
    用堿裂解法除去雜質(zhì)
    1、防止DNA裂解: Solution1
    1)、所含糖增加溶洨黏度,維持滲透壓,防止DNA受機(jī)械剪切作用降解
    2)、所含EDTA抑制酶活性
    2、溶解與變性:Solution2
     
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